Afímero

Estas proteínas de unión feitas por enxeñería non son anticorpos pero están deseñadas para imitar as características de recoñecemento molecular dos anticorpos monoclonais en diferentes aplicacións. Estes reactivos de afinidade foron optimizados para incrementar a súa estabilidade, facéndoos tolerantes a un determinado intervalo de temperaturas e pH, reducir o seu tamaño e incrementar a súa expresión na bacteria Escherichia coli e en células de mamíferos.

As proteínas afímeras (Affimers®) foron desenvolvidas inicialmente na MRC Cancer Cell Unit en Cambridge e en dous laboratorios da Universidade de Leeds. Son proteínas derivadas da familia de inhibidores das cisteina proteases das cistatinas, que funcionan na natureza como inhibidores de cisteína proteases, de 12–14 kDa, que comparten unha estrutura terciaria común cunha hélice alfa situada na parte superior dunha folla beta antiparalela.

As proteínas afímeras presentan dous bucles peptídicos que poden ambos ser aleatorizados para unirse a proteínas diana desexadas, de maneira similar a como o fai un anticorpo monoclonal. A estabilización dos dous péptidos polo andamio da proteína constrinxe as posibles conformacións que os péptidos poden adoptar. Isto incrementa a afinidade de unión e a especificidade en comparación coas bibliotecas de péptidos libres, aínda que pode limitar o repertorio de dianas dos Affimers.

As bibliotecas de phage display de 10⁹ secuencias aleatorizadas utilízanse para cribados para proteínas Affimer que mostran alta especificidade de unión a unha proteína diana con afinidades de unión no rango nM. A capacidade de dirixir técnicas de cribado in vitro permite a identificación de afímeros específicos de alta afinidade. O cribado in vitro e o desenvolvemento tamén significan que o espazo diana para os afímeros non está limitado polo sistema inmunitario do animal. Os afímeros xéranse usando sistemas recombinantes, polo que a súa xeración é máis rápida e reproducible se a comparamos coa produción de anticorpos policlonais.

Xeráronse Affimers multiméricos que renderon titulacións no rango de 200–400 mg/L en cultivos a pequena escala nos que se usaron sistemas hóspedes bacrerianos. As formas multiméricas dos afímeros coa mesma especificidade de diana proporcionan efectos de avidez na unión á diana.

Poden conxugarse cos afímeros moitas etiquetas e proteínas de fusión, como fluoróforos, ADN monocatenario, His e etiquetas c-Myc. Poden introducirse na proteína residuos de cisteína específicos para que a química dos grupos tiol oriente uniformemente os Affimers nun soporte sólido, como pode ser unha placa de ELISA. Esta funcionalización flexible da molécula afímera permite que funcione en múltiples aplicacións e formatos de ensaio.

Os Affimers son proteínas recombinantes. Como se fabrican usando procesos de produción bacteriana recombinante, a consistencia entre distintos lotes dos Affimers é comparativamente mellor que a dos anticorpos policlonais, solucionando algúns dos problemas de reproducibilidade e seguridade de subministración.

Esta especie de "anticorpos" sintéticos foron producidos por enxeñaría para que fosen estables, non tóxicos, bioloxicamente neutros e non contivesen modificacións postraducionais nin pontes disulfuro. Dúas secuencias que forman bucles separadas, que comprenden un total de 12 a 36 aminoácidos, forman a superficie de interacción coa diana, de modo que as superficies de interacción poden oscilar desde 650 a 1000 Å. A gran superficie de interacción facilita a unión das proteínas diana.

A tecnoloxía de Affimers foi comercializada e desenvolvida pola compañía Avacta, que está desenvolvendo estes reactivos de afinidade como ferramentas para o diagnóstico e como bioterapéuticos.

Reactivos e diagnósticos

Os Affimers foron utilizados en diversas plataformas, como en ELISA, resonancia plasmónica de superficie ou purificación de afinidade. Os Affimers que inhiben as interaccións proteína-proteína poden producirse para que teñan a potencialidade de expresar estes inhibidores en células de mamífero e modificar vías de sinalización celular como terapias celulares.

Terapéutica

O pequeno tamaño e perfil de estabilidade dos Affimers combinados coa súa orixe humana danlles propiedades similares ás dun fármaco. Isto pode representar unha vantaxe sobre os anticorpos en canto á súa penetración nos tecidos, por exemplo en tumores sólidos para o que Avacta está desenvolvendo os inhibidores PD-L1 como alternativas aos Opdivo e Yervoy, aínda que isto require a modificación da súa vida media para impedir a súa rápida excreción polos riles.

Os Affimers poden conxugarse para formar multímeros para o deseño de terapéuticas. Exemplos son a produción de moléculas afímeras multiespecíficas para que se unan á albumina para así incrementar a súa vida media in vivo e para usalas como residuos diana en receptores quiméricos ou modificadas para que carrexen unha toxina en conxugados afímero-fármaco.

Os Affimers como substancias terapéuticas están investigándose e en desenvolvemento preclínico para tratar o cancro, tanto por medio de terapia de células CAR-T coma por medio de inhibidores dos puntos de control inmunitarios. Os estudos iniciais utilizando mostras humanas ex vivo indicaron unha baixa inmunoxenicidade asociada co andamio do Affimer, a niveis comparables cos da terapéutica con anticorpos comercializada. Ademais, os estudos preclínicos iniciais mostraron unha boa eficacia e tolerabilidade dos Affimers inmunooncolóxicos anti-PDL1 en ratos. Prevese que a solicitude do permiso IND (Investigational New Drug) nos Estados Unidos para a primeira terapéutica con Affimers ocorrerá en 2023.

Ligazóns externas

• Avacta
• An Introduction to Affimer Technology - video