Evolución Dirixida

Consiste en someter a un xene a repetidas roldas de mutaxénese (creando unha libraría de variantes), de selección (expresando as variantes e illando os membros coa función deexada), e de amplificación (xerando un molde para a seguinte rolda). Pode realizarse in vivo (en células), ou in vitro (libre en solución ou microgota). A evolución dirixida utilízase na enxeñaría de proteínas como unha alternativa ás proteínas modificadas por deseño racional, e tamén en estudos de principios fundamentais da evolución nun ambiente de laboratorio controlado.

 

A evolución dirixida é unha imitación feita no laboratorio do ciclo da evolución natural. Para que se produza a evolución cómpren tres cousas: que haxa variacións entre os replicadores, que a variación cause deferenzas de fitness sobre as cales actúe a selección natural, e que estas variacións sexan herdables. En ED, un só xene faise evolucionar por reiteradas roldas de mutaxénese, selección ou screening, e amplificación. As roldas destes pasos repítense usando a mellor variante dunha rolda como molde para a seguinte para conseguir melloras paso a paso.

A probabilidade de éxito nun experimento de evolución dirixida está directamente relacionada co tamaño total da libraría, xa que avaliar máis mutantes incrementa as probabilidades de atopar unha coas propiedades desexadas.

Xeración de variacións

 

O primeiro paso para realizar un ciclo de evolución dirixida é a xeración dunha libraría de xenes variantes. O espazo de secuencia para a secuencia aleatoria é grande (10¹³⁰ posibles secuencias para unha proteína de 100 aminoácidos) e poboado de forma extremadamente dispersa por proteínas funcionais. Nin a evolución experimental, nin a natural poden nin sequera aproximarse a unha mostraxe con tantas secuencias. Por suposto, a evolución natural mostrea secuencias variantes preto das secuencias de proteínas funcionais e isto é imitado en ED ao someter a mutaxénese a un xene xa funcional. Algúns cálculos suxiren que é perfectamente factible que para todos os propósitos prácticos (é dicir, funcional e estrutural), o espazo de secuencia da proteína fose completamente explorado durante o curso da evolución da vida na Terra.

O xene inicial pode ser sometido a mutaxénese por mutacións puntuais aleatorias (por mutaxénese química ou PCR proclive ao erro) e insercións e delecións (por transposóns). A recombinación de xenes pode ser imitada polo intercambio do ADN de varias secuencias (normalmente con máis dun 70% de homoloxía) para saltar a rexións do espazo de secuencia entre os xenes parentais intercambiados. Finalmente, rexións específicas dun xene poden ser sistematicamente aleatorizadas para unha estratexia máis centrada baseada no coñecemento da estrutura e función. Dependendo do método, a libraría xerada variará na proporción de variantes funcionais que contén. Mesmo se se utiliza un organismo para expresar o xene de interese, sometendo a mutaxénese só ese xene, o resto do xenoma do organismo permanece igual e pode ser ignorado para o experimento evolutivo (para proporcionar un ambiente xenético constante).

Detección de diferenzas de fitness

A maioría das mutacións son deletéreas polo que as librarías de mutantes adoitan ter maiormente variantes con reducida actividade. Por tanto, un ensaio de alto rendemento é vital para medir a actividade para encontrar as raras variantes con mutacións beneficiosas que melloran as propiedades desexadas. Hai dous tipos de métodos para illar variantes funcionais. Os sistemas de selección acoplan directamente a función da proteína coa supervivencia do xene, mentres que os sistemas de screening proban individualmente cada variante e permiten establecer un limiar cuantitativo para escoller unha variante ou poboación de variantes dunha actividade desexada. Tanto a selección coma o screening poden realizarse en células vivas (evolución in vivo) ou realizarse directamente na proteína ou ARN fóra de células (evolución in vitro).

Durante a evolución in vivo, cada célula (xeralmente bacterias ou levedos) é transformada cun plásmido que contén un membro diferente da libraría variante. Deste modo, as células diferenciaranse só no xene de interese, e todos os outros xenes seguen sendo os mesmos. As células expresan a proteína no citoplasma ou na súa surperficie, onde a súa función pode ser comprobada. Este formato ten a vantaxe de seleccionar as propiedades nun ambiente celular, o cal é útil cando a proteína ou ARN feitos evolucionar teñen que utilizarse en organismos vivos. Cando se realiza sen células, a ED implica o uso de transcrición tradución in vitro para producir proteínas ou ARN libre en solución ou comparimentalizado en microgotas artificiais. Este método ten a vantaxe de ser máis versátil nas condicións de selección (por exemplo, temperatura, solvente), e pode expresar proteínas que serían tóxicas para as células. Ademais, os experimentos de evolución in vitro poden xerar librarías moito máis grandes (de ata 10¹⁵) porque a libraría de ADN non necesita ser inserida en células (o que adoita ser un paso limitante).

Selección

A selección de actividade de unión é conceptualmente simple. A molécula diana é mobilizada nun soporte sólido, vértese sobre el unha libraría de proteínas variantes, as moléculas que unan mal son eliminadas por lavado, e as restantes variantes unidas son recuperadas para illar os seus xenes. Utilizouse tamén a unión dun encima a un inhibidor covalente inmobilizado para illar catalizadores activos. Porén, esta estratexia só selecciona un só recambio catalítico e non é un bo modelo de unión a substrato ou da verdadeira reactividade do susbtrato. Se a actividade dun encima se fai necesaria para a superivencia dunha célula, por exemplo para sintetizar un metabolito vital ou para destruír unha toxina, entón a supervivencia da célula é función da actividade encimática. Tales sistemas xeralmente só están limitados en rendemento pola eficacia na transformación das células. Son tamén máis baratos e menos traballosos que o screening, aínda que son normalmente difíciles para facer a enxeñaría, proclives a artefactos e non dan información sobre o rango de actividades presente na libraría.

Screening

Unha alternativa á selección é un sistema de cribado. Cada xene variante é expresado individualmente e probado para medir cuantitativamente a actividade (xeralmente por medio dun produto colorixénico ou fluorixénico). As variantes son despois ordenadas e o experimentador decide que variantes vai usar como moldes para a seguinte rolda de ED. Mesmo os ensaios de maior alto rendemento adoitan ter menor cobertura que os métodos de selección pero teñen a vantaxe de producir información detallada sobre cada unha das variantes sometidas ao screening. Estes datos desagregados poden usarse tamén para caracterizar a distribución de actividades en librarías, o cal non é posible en sistemas de selección simples. Os sistemas de screening, por tanto, teñen vantaxes cando chegan a caracterizar experimentalmente a evolución adaptativa e as paisaxes de fitness.

Asegurar a herdanza

 

Cando se illan proteínas funcionais, é necesario illar tamén os seus xenes, polo que cómpre que haxa unha ligazón xenotipo-fenotipo. Esta pode ser covalente, como no mRNA display no que o xene do ARNm está ligado á proteína ao final da tradución por puromicina. Alternativamente a proteína e o seu xene poden ser colocalizados por compartimentalización en células vivas ou por gotas de emulsión. As secuencias de xenes illadas son despois amplificadas por PCR ou por bacterias hóspedes transformadas. Como moldes para a seguinte rolda de mutaxénese pode utilizarse tanto unha secuencia mellor única coma unha poza de secuencias. Os ciclos repetidos de Diversificación-Selección-Amplificación xeran variantes de proteínas adaptadas ás presións de selección aplicadas.

Vantaxes da evolución dirixida

O deseño racional dunha proteína depende do coñecemento en profundidade da estrutura das proteínas, e o seu mecanismo catalítico. Os cambios específicos fanse por mutaxénese dirixida a sitio para intentrar cambiar a función da proteína. Un inconveniente disto é que mesmo cando a estrutura e o mecanismo de acción da proteína se coñecen ben, o cambio debido á mutación é aínda difícil de predicir. Por tanto, unha vantaxe da ED é que non é preciso comprender o mecanismo da actividade desexada ou como lle afectarán as mutacións.

Limitacións da evolución dirixida

Unha restrición que ten a evolución dirixida é que é necesario un ensaio de alto rendemento para medir os efectos dun gran número de mutacións aleatorias diferentes. Para isto pode ser necesaria unha extensa investigación e desenvolvemento antes de que se poida usar para a evolución dirixida. Ademais, ditos ensaios adoitan ser moi específicos para monitorizar unha actividade particular e así non son transferibles a novos experimentos de ED.

Adicionalmente, seleccionar unha mellora na función ensaiada simplemente xera melloras na función ensaiada. Para comprender como se conseguen esas melloras, hai que medir as propiedades dos encimas que evolucionan. A mellora da actividade ensaiada pode deberse a melloras na actividade catalítica do encima ou á concentración de encima. Ademais non hai garantía de que a mellora sobre un substrato mellorará a actividade sobre outro. Isto é particularmente importantes cando a actividade desexada non pode ser sometida a screening directamente ou seleccionada, así que se usa un substrato ‘proxy’. A ED pode levar a unha especialización evolutiva ao proxy sen mellorar a actividade desexada. En consecuencia, elixir un apropiado screening ou as condicións de selección é esencial para o éxito da ED.

Estratexias combinatorias

As estratexias 'semi-racionais' combinadas están a investigarse para superar as limitacións que teñen tanto o deseño racional coma a evolución dirixida. As mutacións beneficiosas son raras, polo que teñen que ser sometidos a sreeening unha gran cantidade de mutantes aleatorios para encontrar variantes melloradas. As 'librarías enfocadas' (focussed libraries) concéntranse en rexións aleatorizantes que se cre que son máis ricas en mutacións beneficiosas en mutacións artificiais para a fase de mutaxénese da ED. Unha libraría enfocada contén menos variantes que unha libraría de mutaxénese tradicional e así non require dito screening de alto rendemento.

Crear unha libraría enfocada require ter certos coñecementos de que residuos da estrutura hai que mutar. Por exemplo, ter coñecementos sobre o centro activo dun encima pode permitir saber os residuos que interaccionan co substrato para que sexan aleatorizados. Alternativamente, o coñecemento de que rexións das proteínas son variables por natureza pode guiar a mutaxénese a esas rexións.

A evolución dirixida é usada frecuentemente na enxeñaría de proteínas como unha alternativa ao deseño racional, pero pode tamén utilizarse para investigar cuestións fundamentais sobre a evolución dos encimas.

Enxeñaría de proteínas

Como ferramenta para a enxeñaría de proteínas, a ED tivo máis éxito en tres áreas:

1. Mellorar a estabilidade das proteínas para usos biotecnolóxicos a altas temperaturas en solventes fortes.
2. Mellorar a afinidade de unión dos anticorpos terapéuticos (maduración da afinidade) e a actividade de novo de encimas deseñados.
3. Alterar a especificidade de substrato de encimas existentes, (xeralmente para o seu uso en industria).

Estudos de evolución

O estudo da evolución natural está tradicionalmente baseado en organismos existentes e os seus xenes. Porén, a investigación está fundamentalmente limitada pola falta de fósiles (e particularmente a falta de secuencias de ADN antigo) e o coñecemento incompleto das antigas condicións ambientais. A evolución dirixida investiga a evolución nun sistema controlado de xenes para encimas concretos, ribozimas e replicadores (similar á evolución experimental de eucariotas, procariotas e virus).

A ED permite controlar a presión de selección, a taxa de mutación e o ambiente (tanto o ambiente abiótico como a temperatura, coma o ambiente ambiente biótico, como o outros xenes do organismo). Adicionalmente, hai un rexistro completo de todos os xenes intermediarios evolutivos. Isto permite facer medidas detalladas dos procesos evolutivos, por exemplo a epistase, evolucionabilidade, restricións adaptativas paisaxes de fitness, e redes neutrais.

• Aplicacións:
  • Enxeñaría de proteínas
  • Enxeñaría de encimas
  • Deseño de proteínas
  • Código xenético expandido:
  • Mutaxénese aleatoria
• Selección e screening:
  • Yeast display
  • Bacterial display
  • Phage display
  • Ribosome display
  • mRNA display

Ligazóns externas

• Grupos de investigación
  • The Dan Tawfik Research Group
  • The Ulrich Schwaneberg Research Group
  • The Frances Arnold Research Group Arquivado 29 de decembro de 2019 en Wayback Machine.
  • The Huimin Zhao Research Group
  • The Manfred Reetz Research Group
  • The Donald Hilvert Group
  • The Darren Hart Research Group
  • The David Liu Research Group
  • The Douglas Clark Research Group
  • The Paul Dalby Research Group
• SeSaM-Biotech - Directed Evolution
• Prof. Reetz explica o principio da evolución dirixida
• Codexis, Inc.