Fase G0

Clasicamente, pensábase que as células entraban en G₀ principalmente debido a factores ambientais, como a deprivación de nutrientes, que limitban os recursos necesarios para a proliferación. Era considerada como unha fase de repouso. Agora sábese que a G₀ pode adoptar distintas características e aparecer por múltiples razóns. Por exemplo, a maioría das células neuronais adultas, que están entre as células máis activas metabolicamente do corpo, están totalmente diferenciadas e mantéñense nunha fase G₀ terminal. As neuronas permanecen nese estado non debido a unha subministración de nutrientes estocástica ou limitada, senón como parte do seu programa de desenvolvemento.

A G₀ presentouse primeiro como un estado da célula baseándose nos estudos iniciais do ciclo celular. Cando estes primeiros estudos definiron as catro fases do ciclo celular utilizando técnicas de etiquetaxe radioactiva, descubriuse que non todas as células dunha poboación proliferan á mesma velocidade. A "fracción de crecemento" dunha poboación (ou fracción da poboación que estaba crecendo) estaba proliferando activamente, máis outras células esncontrábanse en estado non proliferativo. Algunhas destas células non proliferantes podían responder a estímulos extrínsecos e proliferar ao reentrar no ciclo celular. As ideas iniciais enfrontadas consideraban que as células non proliferantes ou ben eran simplemente células que estaban nunha fase G₁ prolongada ou ben estaban nunha fase do ciclo distinta de G₁, que se denominou G₀. As investigacións posteriores sinalaron que había un punto de restrición (punto R) en G₁ no que as célula poden entrar en G₀ antes de chegar ao punto R, pero quedan destinadas a realizar a mitose despois do punto R. Estes estudos iniciais proporcionaron probas da existencia dun estado G₀ cuxo acceso está restrinxido. Estas células que non se dividen máis saen da fase G₁ para entrar no estadio inactivo chamado estadio quiescente.

 

Existen tres estados G₀ e poden clasificarse como reversibles (quiescente) ou irreversibles (senescente e diferenciado). Pode entrarse en cada un destes tres estados desde a fase G₁ antes de que a célula quede comprometida a realizar a seguinte rolda do ciclo celular.

A quiescencia refírese a un estado G₀ reversible no que as subpoboacións de células están nun estado de repouso ou 'quiescente' antes de entraren no ciclo celular despois de activárense en resposta a sinais extrínsecos. As células quiescentes son a miúdo identificadas por un contido baixo en ARN, falta de marcadores de proliferación celular e incremento da retención de etiquetas indicando un baixo recambio celular.

A senescencia é distinta da quiescencia porque a senescencia é un estado irreversible no que entran as células en resposta á degradación ou danos no ADN que farían que a proxenie da célula fose inviable. Ditos danos no ADN poden ocorrer polo acurtamento dos telómeros despois de moitas divisións celulares, así como pola exposición a especies reactivas do oxíxeno, activación de oncoxenes e fusión de células. Aínda que as células senescentes xa non se poden replicar, seguen sendo capaces de realizar moitas funcións celulares normais. A senescencia é a miúdo unha alternativa bioquímica á autodestrución dunha desas células danadas por apoptose. A diferenza da senescencia celular, a quiescencia non é un evento reactivo, senón parte da programación básica de diferentes tipos celulares.

Finalmente, as células diferenciadas proceden de células nais que progresaron ao longo dun programa de diferenciación para chegaren a un estado maduro (terminalmente diferenciado). Estas células diferenciadas permanecen en G₀ e realizan as súas principais funcións indefinidamente.

Transcritomas

Os transcritomas de varios tipos de células nais quiescentes, como as hematopoéticas, musculares e do folículo piloso, foron caracterizadas por técnicas de alto rendemento, como as micromatrices e secuenciación de ARN. Aínda que hai variacións nos seus transcritomas individuais, a maioría das células nais de tecidos quiescentes comparten un padrón común de expresión xénica que implica a regulación á baixa de xenes para a progresión do ciclo celular, como os da ciclina A2, ciclina B1, ciclina E2 e survivina, e a regulación á alza de xenes implicados na regulación da transcrición e destino de células nais, como FOXO3 e EZH1. A regulación á baixa do citocromo c mitocondrial tamén reflicte o estado metabólico baixo de células nais quiescentes.

Epixenética

Moitas células nais quiescentes, especialmente células nais adultas, tamén comparten padróns epixenéticos similares. Por exemplo, H3K4me3 e H3K27me3, son dous importantes padróns de metilación de histonas que forman un dominio bivalente e están localizados preto dos sitios de iniciación da transcrición. Estes marcadores epixenéticos regulan decisións de liñaxe nas células nais embrionarias e controlan a quiescencia no folículo piloso e células nais musculares por medio de modificacións da cromatina.

Reguladores do ciclo celular

Os xenes supresores de tumores funcionais, especialmente p53 e Rb, son necesarios para manter as células nais quiescentes e impedir o esgotamento do conxunto de células proxenitoras por causa de divisións excesivas. Por exemplo, a deleción dos tres compoñentes da familia proteica Rb detén a quiescencia en células nais hematopoéticas. A carencia de p53 impide a diferenciación destas células nais debido á incapacidade das células de saíren do ciclo celular e pasaren á fase G₀. Ademais de p53 e Rb, os inhibidores de quinases dependentes de ciclinas (CKIs), como p21, p27 e p57 son tamén importantes para o mantemento da quiescencia. Nas células nais hematopoéticas de ratos o knockout de p57 e p27 leva á saída de G₀ pola importación nuclear de ciclina D1 e a subseguinte fosforilación de Rb. Finalmente, a vía de sinalización Notch xoga un importante papel no mantemento da quiescencia.

Regulación postranscricional

A regulación postranscricional da expresión xénica por medio da síntese de microARN exerce un papel igualmente importante no mantemento da quiescencia das células nais. As febras de microARN únense á rexión non traducida 3’ (3’ UTR) de ARNms diana, impedindo a súa tradución en proteínas funcionais. A lonxitude do 3’ UTR dun xene determina a súa capacidade de unirse a febras de microARN, permitindo dese modo a regulación da quiescencia. Algúns exemplos de microARNs en células nais son o miR-126, que controla a vía PI3K/AKT/mTOR en células nais hematopoéticas, o miR-489, que suprime o oncoxene DEK en células nais musculares, e o miR-31, que regula Myf5 nas células nais musculares. O secuestro de microARN de ARNm dos complexos de ribonucleoproteínas permite que as células quiescentes almacenen o ARNm que cómpre para unha entrada rápida na fase G₁.

Resposta ao estrés

As células nais que estiveron quiescentes durante longo tempo adoitan enfrontarse a varios estresores ambientais, como o estrés oxidativo. Porén, varios mecanismos permiten que estas células respondan a tales estresores. Por exemplo, os factores de transcrición FOXO responden á presenza de especies reactivas do oxíxeno, mentres que HIF1A e LKB1 responden a condicións hipóxicas. En células nais hematopoéticas, a autofaxia indúcese para responder ao estrés metabólico.

Células nais dos tecidos

As células nai son células coa capacidade exclusiva de producir células fillas diferenciadas e á vez preservar a súa identidade como células nais autorrenovadas. En mamíferos a maioría dos tecidos adultos conteñen células nais específicas de tecidos que residen no tecido e proliferan para manter a homeostase durante toda a vida do organismo. Estas células poden sufrir unha inmensa proliferación en resposta aos danos nos tecidos antes de diferenciarse e dedicarse á rexeneración. Algunhas células nais dos tecidos están indefinidadmente nun estado reversible quiescente ata seren activadas por estímulos externos. Hai moitos tipos de células nais dos tecidos, como as células nais musculares, células nais neurais, células nais intestinais e moitas outras.

Suxeriuse recentemente que as células nais quiescentes están compostas de dúas fases funcionalmente diferentes, G₀ e unha fase de "alerta" denominada G_Alerta. Crese que as células nais fan unha transición activa e reversible entre estas fases para responderen aos estímulos das lesións e parecen potenciar a función rexenerativa dos tecidos en G_Alerta. Así, propúxose que a transición a G_Alerta é unha resposta adaptativa que permite que as células nais respondan rapidamente ás lesións ou estreses ao preparalas para a entrada no ciclo celular. Nas células nais musculares, a actividade de mTORC1 controla a transición de G₀ a G_Alerta xunto coa sinalización polo receptor do HGF cMet.

Hepatocitos maduros

Aínda que o estado quiescente reversible é quizais máis importante para as células nai dos tecidos para responder rapidamente aos estímulos e manter unha axeitada homeostase e rexeneración, as fases G₀ reversibles poden encontrarse en células que non son células nai como os hepatocitos maduros. Os hepatocitos son tipicamente quiescentes en fígados normais pero sofren unha replicación limitada (menos de dúas divisións celulares) durante a rexeneración do fígado despois dunha hepatectomía parcial. Porén, en certos casos, os hepatocitos poden experimentar unha inmensa proliferación (máis de 70 divisións celulares), o que indica que a súa capacidade de proliferación non é dificultada por existir nun estado quiescente reversible.

Células senescentes

As células senescentes, a miúdo asociadas co envellecemento e doenzas relacionadas coa idade in vivo, poden atoparse en moitos tecidos renovables, incluíndo o estroma, vasos sanguíneos, sistema hematopoético e moitos órganos epiteliais. A senescencia, que resulta da acumulación de moitas divisións celulares, é a miúdo vista en fenotipos dexenerativos asociados á idade. Os fibroblatos senescentes en modelos da función das células epiteliais de mama interrompen a produción de proteínas do leite debido á secreción de metaloproteinases da matriz. De xeito similar, as células de músculo liso das arterias pulmonares senescentes causan que células musculares lisas veciñas proliferen e migren, quizais contribuíndo á hipertrofia das arterias pulmonares e finalmente á hipertensión pulmonar.

Músculo diferenciado

Durante a mioxénese esquelética as células proxenitoras que se dividen chamadas mioblastos diferéncianse e fusiónanse en células musculares que non se dividen chamadas miocitos, que permanecen nunha fase G₀ terminal. Como resultado, as fibras musculares que forman o músculo esquelético son células con múltiples núcleos, denominados mionúcleos, xa que cada mionúcleo se orixinou a partir dun mioblasto. As células do músculo esquelético continúan indefinidamente proporcionando forza contráctil por medio da contraccións das súas estruturas celulares chamadas sarcómeros. Estas células permanecen nunha fase G₀ terminal, xa que a alteración da estrutura da fibra muscular despois da súa formación impediría a correcta transmisión da forza en toda a lonxitude do músculo. O crecemento do músculo pode ser estimulado polo crecemento do organismo ou lesión e implica o recrutamento de células nais musculares, tamén coñecidas como células satélite, que saen dun estado quiescente reversible. Estas células nai diferéncianse e fusiónanse para xerar novas fibras musculares tanto en paralelo coma en serie para incrementar a capacidade de xeración de forza.

O músculo cardíaco tamén se forma por mioxénese, pero en vez de recrutar células nais para que se fusionen e formen novas células, as células musculares cardíacas, chamadas cardiomiocitos, simplemente incrementan o seu tamaño a medida que crece o corazón. De xeito similar ao múculo esquelético, se os cardiomiocitos tivesen que continuar dividíndose para engadir novo tecido muscular, as estruturas contráctiles necesarias para o funcionamento do corazón veríanse alteradas.

Óso diferenciado

Dos catro grandes tipos de células óseas, os osteocitos son as máis comúns e tamén existen nunha fase G₀ terminal. Os osteocitos orixínanse a partir dos osteoblastos que quedan atrapados dentro da matriz ósea que eles mesmos segregaron. Aínda que os osteocitos teñen tamén unha capacidade sintética reducida, aínda desempeñan funcións no óso ademais de xerar a estrutura. Os osteocitos funcionan por medio de varios mecanismos mecanosensores para axudaren a osteoblastos e osteoclastos na reciclaxe da matriz ósea rutineira.

Nervios diferenciados

Á parte duns poucos nichos neuroxénicos no cerebro, a maioría das neuronas están completamente diferenciadas e atópanse nunha fase G₀ terminal. Estas neuronas completamente diferenciadas forman sinapses nas que os sinais eléctricos se transmiten polos axóns das neuronas ás dendritas das neuronas veciñas. Neste estado G₀ as neuronas continúan funcionando ata a súa senescencia ou apoptose. Numerosos estudos informaron da acumulación de danos no ADN coa idade, especialmente danos oxidativos, no cerebro de mamíferos.

Papel de Rim15

Rim15 sábese que xoga un papel fundamental no inicio da meiose en células de lévedos diploides. Baixo condicións de baixos niveis de glicosa e nitróxeno, que son nutrientes clave para a supervivencia dos lévedos, as células de lévedos diploides inician a meiose por medio da activación de xenes específicos da meiose temperá (EMGs). A expresión dos EMGs está regulada por Ume6. Ume6 recruta as histona desacetilases Rpd3 e Sin3, para reprimir a expresión dos EMGs cando os niveis de glicosa e nitróxeno son altos, e recruta o factor de transcrición de EMGs Ime1 cando ditos niveis son baixos. Rim15, denominado así polo seu papel na regulación dun EMG chamado IME2, despraza Rpd3 e Sin3, permitindo así que Ume6 traia Ime1 aos promotores de EMGs para a iniciación da meiose.

Ademais de xogar un papel na iniciación da meiose, Rim15 tamén é un efector fundamental para a entrada da célula do lévedo en G₀ en presenza de estrés. Os sinais de varias vías de sinalización de nutrientes converxen en Rim15, que activa os factores de transcrición Gis1, Msn2 e Msn4. Gis1 únese para activar promotores que conteñen elementos de cambio post-crecemento diáuxico, mentres que Msn2 e Msn4 se unen para activar promotores que conteñen elementos de resposta ao estrés. Aínda que non está claro como Rim15 activa Gis1 e Msn2/4, tense especulado que pode fosforilalos directamente ou estar implicado na remodelación da cromatina. Rim15 tamén contén un dominio PAS no seu N-terminal, o que fai que sexa un novo membro descuberto da familia da quinase PAS. O dominio PAS é unha unidade regulatoria da proteína Rim15 que pode exercer un papel na percepción do estrés oxidativo en lévedos.

Vías de sinalización de nutrientes

Glicosa

Os lévedos crecen exponencialmente por fermentación da glicosa. Cando os niveis de glicosa caen, os lévedos cambian a fermentación pola respiración celular, metabolizando os produtos fermentativos da súa fase de crecemento exponencial. Este cambio coñécese como cambio diáuxico, despois do cal o lévedo entra en G₀. Cando os niveis de glicosa nos arredores son altos, a produción de AMPc pola vía RAS-AMPc-PKA (unha vía dependente do AMPc) elévase, causando que a proteína quinase A (PKA) inhiba a súa diana de augas abaixo Rim15 e permita a proliferación celular. Cando os niveis de glicosa caen, a produción de AMPc declina, levantando a inhibición que facía PKA sobre Rim15 e permitindo que a célula do lévedo entre en G₀.

Nitróxeno

Ademais de glicosa, a presenza de nitróxeno é crucial para a proliferación dos lévedos. En condicións de baixos niveis de nitróxeno, Rim15 actívase para promover a detención do ciclo celular pola inactivación das proteína quinases TORC1 e Sch9. Mentres que TORC1 e Sch9 pertencen a dúas vías separadas, concretamente a vía inducida de TOR e a vía do Medio de Crecemento Fermentable, respectivamente, ambas as proteína quinases actúan promovendo a retención citoplasmática de Rim15. En condicións normais, Rim15 está ancorado á proteína 14-3-3 citoplásmica Bmh2, pola fosforilación da súa Thr1075. TORC1 inactiva certas fosfatases no citoplasma, mantendo Rim15 ancorada a Bmh2, mentres que Sch9 promove a retención citoplasmática de Rim15 por fosforilación doutro sitio de unión 14-3-3 preto da Thr1075. Cando o nitróxeno extracelular é baixo, TORC1 e Sch9 están inactivadas, permitindo a desfosforilación de Rim15 e o seu transporte ao núcleo, onde pode activar factores de transcrición implicados en promocionar a entrada da célula en G₀. Tamén se encontrou que Rim15 promove a súa propia exportación desde o núcleo por autofosforilación.

Fosfato

As células de lévedos responden a niveis baixos de fosfato extracelular activando xenes que están implicados na produción e regulación á alza do fosfato inorgánico. A vía PHO está implicada na regulación dos niveis de fosfato. En condicións normais, o complexo da quinase dependente de ciclina Pho80-Pho85 do lévedo inactiva o factor de transcrición Pho4 por fosforilación. Porén, cando os niveis de fosfato caen, Pho81 inhibe Pho80-Pho85, permitindo que Pho4 estea activa. Cando o fosfato é abondoso, Pho80-Pho85 tamén inhibe o pool nuclear de Rim 15 ao promover a fosforilación do seu sitio de unión a Bmh2 na Thr1075. Así, Pho80-Pho85 actúa en concerto con Sch9 e TORC1 promovendo a retención citoplasmática de Rim15 cando as condicións son normais.

Ciclina C/Cdk3 e Rb

A transición da fase G₁ á fase S é promovida pola inactivación de Rb pola súa progresiva hiperfosforilación realizada polos complexos ciclina D/Cdk4 e ciclina E/Cdk2 ao final de G₁. A observación inicial de que a perda de Rb promovía a reentrada no ciclo celular en células en G₀ suxeriu que Rb é tamén esencial para regular a transición de G₀ a G₁ en células quiescentes. Posteriores observacións revelaron que os niveis do ARNm da ciclina C son máximos cando as células humanas saen de G₀, o que suxire que a ciclina C pode estar implicada na fosforilación de Rb para promover a reentrada no ciclo celular de células paradas en G₀. Ensaios de quinases de inmunoprecipitación revelaron que a ciclina C ten actividade de quinase Rb. Ademais, a diferenza das ciclinas D e E, a actividade de quinasa Rb da ciclina C é máxima durante os inicios de G₁ e a menor durante o final de G₁ e na fase S, o que indica que pode estar implicada na transición de G₀ a G₁. O uso de clasificación de células activada por fluorescencia para identificar células en G₀, que se caracterizan por unha alta proporción ADN/ARN comparadas coas células en G₁, confirmou a sospeita de que a ciclina C promove a saída de G₀, xa que a represión da ciclina C endóxena por interferencia de ARN en células de mamífero incrementaba a proporción de células detidas en G₀. Posteriores experimentos que implicaban a mutación de Rb en sitios de fosforilación específicos mostraron que cómpre a fosforilación por parte de ciclina C de Rb en S807/811 para a saída de G₀. Porén, non queda claro se este padrón de fosforilación é suficiente para a saída de G₀. Finalmente, os ensaios de coinmunoprecipitación revelaron que a quinase dependente de ciclina 3 (cdk3) promove a saída de G₀ ao formar un complexo coa ciclina C para fosforilar Rb en S807/811. Un dato interesante é que S807/811 son tamén as dianas da fosforilación feita pola ciclina D/cdk4 durante a transición de G₁ a S. Isto podería indicar unha posible compensación da actividade de cdk3 por cdk4, especialmente á luz da observación de que a saída de G₀ só está atrasada, pero non permanentemente inhibida, en células que carecen de cdk3 pero teñen unha cdk4 funcional. Malia o solapamento de dianas de fosforilación, parece que cdk3 é aínda necesaria para unha transición máis efectiva de G₀ a G₁.

Saída de Rb e G₀

Os estudos suxiren que a represión por Rb da familia E2F de factores de transcrición regula a transición de G₀ a G₁ igual que fai coa transición de G₁ a S. Os complexos E2F activantes están asociados co recrutamento de histona acetiltransferases, as cales activan a expresión xénica necesaria para a entrada en G₁, mentres que os complexos E2F4 recrutan histona desacetilases, que reprimen a expresión xénica. A fosforilación de Rb polos complexos Cdk permite a súa disociación dos factores de transcrición E2F e a subseguinte expresión dos xenes necesarios para a saída de G₀. Outros membros da familia de proteínas peto (pocket) Rb, como p107 e p130, tamén están implicados na detención na fase G₀. Os niveis de p130 están elevados en G₀ e están asociados con complexos E2F-4 para reprimir a transcrición de xenes diana de E2F. Por outra parte, p107 rescata o fenotipo de detención celular despois da perda de Rb incluso se p107 se expresa a un nivel comparativamente baixo en células en G₀. En conxunto, estes descubrimentos sinalan que a represión feita por Rb dos factores de transcrición E2F promove a detención celular mentes que a fosforilación de Rb leva á saída de G₀ pola desrepresión de xenes diana de E2F. Ademais da súa regulación de E2F, Rb tamén suprime a ARN polimerase I e a ARN polimerase III, as cales interveñen na síntese de ARNr. Así, a fosforilación de Rb tamén permite a síntese de ARNr, que é esencial para a síntese de proteínas despois da entrada en G₁.