Elisa Test

Analiza koristi čvrstu fazu tipa enzimskog testa (EIA) za otkrivanje prisustva liganda (obično proteina) u tečnom uzorku, koristeći antitijela usmjerena na protein koji se mjeri. Eliza se koristi kao dijagnostički alat u medicini, biljnoj patologiji i biotehnologiji, kao i kontroli kvaliteta u različitim industrijama.

U najjednostavnijem obliku elizee, antigeni iz uzorka koji se testira pričvršćeni su na površinu. Zatim se na površinu nanosi odgovarajuće antitijelo, kako bi moglo vezati antigen. Ovo antitijelo veže se za enzim, a zatim se uklanjaju sva nevezana antitijela. U završnom koraku dodaje se supstanca koja sadrži enzim supstrat. Ako je došlo do vezanja, naknadna reakcija proizvodi prepoznatljiv signal, najčešće promjenom boje.

Izvođenje testa uključuje najmanje jedno antitelo, specifično za određeni antigen. Uzorak sa nepoznatom količinom antigena imobilizira se na čvrstom nosaču (obično polistirenska mikrotitarska ploča) ili nespecifično (putem adsorpcije na površinu) ili posebno (hvatanjem pomoću drugog antitela specifičnog za isti antigen, u tzv. "sendvič"-elizi). Nakon imobilizacije antigena, dodaju se detektirajuća antitijela, formirajući kompleks sa antigenom. Detekcijsko antitijelo može se kovalentno povezati sa enzimom ili ga samo može detektirati sekundarno antitijelo, koje je povezano sa enzimom putem biokonjugacije. Između svakog koraka, pločica se obično opere blagim deterdžentnim rastvorom kako bi se uklonili svi proteini ili antitijela koja nisu specifično vezana. Nakon završnog pranja, ploča se razvija dodavanjem enzimskog supstrata, da bi se dobio vidljivi signal, koji ukazuje na količinu antigena u uzorku.

Treba napomenuti da eliza-test može uklhučiti i druge oblike testova vezanja liganda, umjesto strogo "imunskih" testova, iako je naziv nosio originaln prefiks "imuno", zbog uobičajene upotrebe i historije razvoja ovog metoda. Tehnika u osnovi zahtijeva bilo koji reagirajući reagens koji se može imobilizirati na čvrstoj fazi zajedno s reagensom za detekciju, koji će se specifično vezati i koristiti enzim za generiranje signala kojeg se može pravilno kvantificirati. Između ispiranja, samo ligand i njegovi specifični vezivni dijelovi ostaju specifično vezani ili "imunosorbantni", pomoću interakcije antigen-antitijelo na čvrstu fazu, dok se nespecifične ili nevezane komponente ispiraju. Za razliku od ostalih spektrofotometrijskih formata za mokro laboratorijsko ispitivanje, u kojima se ista reakcijska posuda (npr. liveta) može ponovo upotrijebiti nakon pranja, ploče za elizu imaju reakcijske produkte imunosorbirane na čvrstoj fazi, koja je dio ploče, pa ih nije lahko ponovno iskoristiti.

Kao analitički biohemijski test i tehnika "mokre laboratorije", eliza uključuje otkrivanje analita (tj. specifične supstance, čija se prisutnost kvantitativno ili kvalitativno analizira) u uzorku tečnosti metodom koji i dalje koristi tečni reagens tokom analize (tj. kontroliranog slijeda biohemijskih reakcija koji će generirati signal za lahko kvantificiranje i tumačenje, kao mjere količine analita u uzorku) koji ostaje tečan i unutar reakcijske komore ili prijeko potreban za zadržavanje reaktanata. To je za razliku od tehnika "suhe laboratorije" koja koristi suhe trake. Čak i ako je uzorak tečan (npr. Izmjereni mali pad), završni korak otkrivanja u "suhoj" analizi uključuje očitavanje osušene trake metodima kao što je reflektometrija i nije potrebna komora za zadržavanje reakcije, kako bi se spriječilo prelijevanje ili miješanje između uzoraka .

Kao heterogeni test, eliza odvaja neke komponente analitičke reakcijske smjese adsorbujući određene komponente na čvrstu fazu, koja je fizički imobilizirana. U ovom testu, tečni uzorak dodaje se u stacionarnu čvrstu fazu sa posebnim svojstvima vezanja, nakon čega slijedi više tekućih reagensa koji se sekvencijalno dodaju, inkubiraju i ispiru. Makon toga slijedi neka optička promjena (npr. razvoj boje proizvodom enzimskih reakcija) u konačnoj tečnosti u jažici iz koje se mjeri količina analita. Kvantitativno "očitavanje" obično se zasniva na detekciji intenziteta propuštene svjetlosti, pomoću spektrofotometrije, što uključuje kvantitativno prenošenje neke određene talasne dužine svjetlosti kroz tečnost (kao i prozirno dno komorice u višestruko-formatiranoj ploči posudica). Osetljivost detekcije zavisi od pojačanja signala tokom analitskih reakcija. Budući da su enzimske reakcije vrlo poznati procesi pojačavanja, signal generiraju enzimi koji su povezani sa reagensima za detekciju u fiksnim omjerima, kako bi se omogućila precizna kvantifikacija, a samim tim jw i naziv "enzimski vezana".

Analit se naziva i ligand, jer će se specifično vezati ili povezati sa reagensom za detekciju, pa eliza spada u veću kategoriju testova vezanja liganada. Reagens za vezanje specifičan za ligand je "imobiliziran", tj. obično je premazan i osušen na prozirnom dnu, a ponekad i na bočnom zidu mjesta za uzorak (stacionarna "čvrsta faza" / "čvrsta podloga" ovdje, za razliku od čvrstih mikročestica / kuglica koje se mogu isprati), koja je obično izrađena kao ploča s više jažica poznata kao "eliza ploča". Konvencijskio, kao i drugi oblici imunoeseja, koristi se specifičnost reakcije tipa antigen – antitijelo, jer je lahko podići antitijelo specifično protiv antigena u rinfuzi kao reagensa. Alternativno, ako je analit sam antitijelo, njegov ciljni antigen može se koristiti kao vezivni reagens.

Postoje mnogi eliza-testovi za određene molekule, koji koriste odgovarajuća antitijela. Podeljeni su u nekoliko tipova, zasnovanih na načinu vezanja i upotrebe analita i antitijela.

Direktna eliza

 

Sendvoč-eliza

 

Kompetitivna eliza
Reverzna eliza

Sljedeća tabela navodi enzimske markere koji se obično koriste u eliza-testovima, koji omogućavaju mjerenje rezultata ispitivanja po završetku.

• OPD (o-fenilendiamin dihidroklorid) pretvara jantar za otkrivanje HRP-a (hrenove peroksidaze), koji se često koristi kao konjugirani protein.
• TMB (3,3',5,5'- tetrametilbenzidin) postaje plav kada otkriva HRP i žut nakon dodavanja sumporne ili fosforne kiseline.
• ABTS (2,2'-azinobis [3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina] - diamonijeva so) postaje zelena kada otkriva HRP.
• PNPP (p- nitrofenil-fosfat, dinatrijeva so) postaje žuta pri otkrivanju alkalne fosfataze.

 

Budući da se eliza može provesti za procjenu prisustva antigena ili prisustva antitijela u uzorku, to je koristan alat za određivanje koncentracije serumskih antitijela (kao što je HIV- test ili testa za virus zapadnog Nila). Također je pronašao primjenu i u prehrambenoj industriji, u otkrivanju potencijalnih alergena u hrani, kao što su mlijeko, kikiriki, orah, badem i jaja te kao serološki test krvi za celijakiju. Također se može koristiti u toksikologiji kao brzi pretpostavljeni pregled za određene klase lijekova.

 

Eliza je prvi skrining test koji se široko koristi za dijagnostiku HIV-a zbog svoje visoke osjetljivosti. Osobni razblaži se 400 puta i nanese na ploču na koju su vezani HIV antigeni. Ako su antitijela na HIV prisutna u serumu, mogu se vezati za ove HIV antigene. Zatim se ploča opere kako bi se uklonile sve ostale komponente seruma. Na ploču se zatim nanosi posebno pripremljeno "sekundarno antitijelo" – antitelo koje se veže za druga antitijela, nakon čega slijedi još jedno ispiranje. Ovo sekundarno antitijelo je pretnodno hemijski vezano za enzim.

Dakle, pločica će sadržavati enzim proporcionalno količini sekundarnog antitijela vezanog za ploču. Primjenjuje se supstrat za enzim, a kataliza enzima dovodi do promjene boje ili fluorescencije. Rezultati testa prikazani su kao broj; najkontroverzniji aspekt ovog testa je određivanje "granične tačke" između pozitivnog i negativnog rezultata.

Tačka prekida može se odrediti upoređivanjem sa poznatim standardom. Ako se ovaj test koristi za provjeru lijekova na radnom mjestu, uspostavlja se granična koncentracija, naprimjer, 50 ng /ml, a pripremit će se uzorak koji sadrži standardnu koncentraciju analita. Nepoznate koje generiraju jači signal od poznatog uzorka su "pozitivne". One koji generiraju slabiji signal su "negativne".

Dr Dennis E Bidwell i Alister Voller kreirali su eliza test za otkrivanje različitih tipova bolesti, kao što su denga, malarija, Chagasova bolest, Johneova bolest i druge. Eliza testovi se također koriste u in vitro dijagnostici u medicinskim laboratorijama. Ostale oblasti upotrebe uključuju:

• otkrivanje Mycobacterium antitijela u tuberkulozi;
• otkrivanje rotavirusa u fecesu;
• otkrivanje markera hepatitiisa B u serumu;
• otkrivanje markera hepatitisa C u serumu;
• otkrivanje enterotoksina E. coli u izmetu;
• otkrivanje HIV antitijela u uzorcima krvi;
• otkrivanje SARS-CoV-2 antitijela u uzorku krvi.

 

	Portal Biologija
	Portal Tehnologija
	Portal Hemija

• Aglutinacija
• PCR
• Imunoskrining
• Test bočnog protoka
• Mikrotitarska ploča
• Čitač ploča
• Test sekrecije

• ELISA na US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)
• "Introduction to ELISA Activity"—beginner walk-through of ELISA used for detecting HIV, including animations at the University of Arizona

Šablon:Imunološke tehnike i testovi