Secondogenito di Cookie e Bob Fillion, Nathan nasce a Edmonton; lì frequenta la Holy Trinity Catholic High School e, in seguito, il Concordia University College e l'Università dell'Alberta, dove inizia il suo percorso di studi che gli avrebbe dato accesso a una carriera nell'insegnamento, seguendo le orme dei genitori e di Jeff, suo fratello maggiore. A pochi mesi dalla laurea, nel 1994, ha l'opportunità d'interpretare il ruolo di Joey Bauchannan nella soap opera Una vita da vivere. Decide perciò di abbandonare il sogno della cattedra per dedicarsi interamente alla recitazione, trasferendosi a New York. Ha la doppia cittadinanza canadese e statunitense, avendo ottenuto quest'ultima nel 1997. Ha origini francesi, finlandesi e norvegesi.
Nel 1996, proprio grazie al ruolo di Joey riceve una candidatura ai Daytime Emmy Award, decidendo l'anno successivo di lasciare la soap (salvo farvi ritorno nel 2007, come guest star per una breve comparsata). Nel 1998 ottiene un piccolo ruolo nel film di Steven SpielbergSalvate il soldato Ryan, e successivamente lavora nella commedia Sbucato dal passato e nell'horror Dracula's Legacy - Il fascino del male. Per tre anni, dal 1999 al 2001, è nel cast della sitcomDue ragazzi e una ragazza.
Dal 2009 al 2016 è protagonista della serie televisiva Castle, nei panni dello scrittore di romanzi gialli Richard Castle, affiancato dalla connazionale Stana Katic nei panni della detective Kate Beckett; il ruolo di Castle, oltre a conferirgli un grande successo, gli permette di ottenere nel 2009 una candidatura ai Satellite Award nella categoria "miglior attore" . Nel 2013 è nel cast del film Percy Jackson e gli dei dell'Olimpo - Il mare dei mostri, dove interpreta il ruolo di Hermes andando così a sostituire Dylan Neal, precedente interprete del ruolo ne Il ladro di fulmini. Dal 2018 è protagonista della serie poliziesca The Rookie.
2011 - Favorite Couple Who Should Get Together per Castle (condiviso con Stana Katic)
2012 - Favorite TV Couple per Castle (condiviso con Stana Katic)
2013 - Favorite TV Couple per Castle (condiviso con Stana Katic)
2014 - Candidatura al miglior attore per Castle
Doppiatori italiani
Nelle versioni in italiano delle opere in cui ha recitato, Nathan Fillion è stato doppiato da:
Andrea Lavagnino in Castle, Percy Jackson e gli dei dell'Olimpo - Il mare dei mostri, The Big Bang Theory, Santa Clarita Diet, Modern Family, The Rookie, The Suicide Squad - Missione suicida, Guardiani della Galassia Vol. 3
Francesco Bulckaen in Salvate il soldato Ryan, Dracula's Legacy - Il fascino del male
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