1981年（昭和56年）1月から順次田町電車区に配置された。1981年3月26日より、153系電車の付属編成を置き換える形で運用が開始されたが、特急形車両でありながら初運用は普通列車であった。急行「伊豆」は翌々日の1981年3月28日から使用された。これらの運用途上では153系電車と連結して運用されることもあった。

1981年7月までに0番台の115両が出揃い、1981年10月1日からエル特急「踊り子」7往復と、朝夕の普通列車10往復で運用が開始されたが、この時点では特急「あまぎ」に使用されていた183系電車を「踊り子」3往復に運用していた。153系電車の運用のうち、普通列車のみの運用は113系電車が82両製造されて置き換えられている。

明るいカラーリングにより新鮮なイメージは利用客に好印象を与えたが、急行の全廃により特急に乗らざるを得なくなり実質的な値上げとする意見に加えて、ピーク時間帯を外れても2扉デッキ付き車両の普通列車運用は遅延を招いていた。185系電車が登場した頃は既に、東海道線で2扉デッキ付き車両による通勤輸送は困難であった。

この時の車両は、置き換えの対象となる165系電車の運用を考慮して耐寒耐雪装備や横軽対策が施され、200番台として区分された。200番台は新前橋電車区に配置され、1982年3月10日から165系電車の運用に投入を開始し、急行「あかぎ」で運用を開始、増備とともに急行「ゆけむり」「草津」「軽井沢」や普通列車で運用された。この年の8月16日に特急「白根」4号・5号に200番台が運用されたが、これが200番台で初の特急運用となった。

国鉄は東北・上越新幹線の建設を進めていたが、上野から大宮までの区間において用地買収が難航したため、「1982年春に大宮を起点とする暫定開業」を1980年12月に決定していた。この暫定開業時に上野と大宮の間で新幹線連絡専用列車を運行することとなり、この連絡列車にも185系電車を運用することとしたため200番台は49両が追加製造された。会計検査院は「東北新幹線が東京まで乗り入れた場合は185系電車は余剰となる」と反対したが、「新幹線接続という一体感」のある新車による輸送サービスは最低限必要で新幹線開通後の185系電車は近距離特急に使用する予定、と説明して会計検査院の理解に半年を要した。1982年6月23日の東北新幹線開業と同時に185系200番台を使用した「新幹線リレー号」の運行が開始され、「やまびこ」4往復と「あおば」6往復が設定されて各列車に接続する運行体制であった。

1982年11月15日の上越新幹線開業から新幹線リレー号は28往復に増発され、同時に特急「谷川」・「白根」・「あかぎ」や一部の普通列車にも運用が開始された。普通列車では、信越本線高崎 - 軽井沢・中軽井沢間の普通運用に投入されて碓氷峠を越えたことが特筆される。この冬期に特急「谷川」が石打まで延長運転され、スキー客向けの臨時特急「新雪」にも185系200番台が運用された。1983年（昭和58年）夏期に特急「そよかぜ」のうち51号・52号が185系200番台で運用された。

余剰となった200番台のうち4編成は新前橋電車区から田町電車区へ転属となり、それまで「踊り子」の一部に使用されていた183系を置き換え、置き換えられた183系電車は長野運転所へ転属した。田町電車区へ転属した4編成のうち、1編成は転属前に斜めストライプ塗装に変更されたが、その他の3編成は横帯1本の塗装のままで使用されて順次0番台と同様の斜めストライプに変更され、「踊り子」は全列車が185系電車によって運行されることになった。それまでクロ157を使用したお召し列車は田町電車区の183系電車が使用されていたが、田町電車区から183系電車が転出したことに伴い、185系電車がクロ157と連結して運用された。1986年（昭和61年）1月からスキー専用列車「シュプール号」の運行が開始され、田町電車区の185系電車B編成が「シュプール上越号」に運用された。

1990年の1月から2月にかけて運行された臨時特急「かいじ」191号・192号は、田町電車区の185系電車B編成が運用された。1991年3月16日のダイヤ改正からは、東海道線の小田原 - 熱海間の普通列車に田町電車区の185系電車C編成が運用された。これは分割併合のない列車としては唯一、付属編成が単独運用される列車であった。一方、1991年夏に、上越新幹線と連絡して運行する臨時普通列車「軽井沢リレー」の2号・3号に新前橋電車区の185系電車が運用された。

1992年3月14日のダイヤ改正では、「湘南ライナー」の一部が215系電車に置き換えられた一方、「新特急なすの」が上りのみ1便増発されることになったが、これにあわせて「ホームライナー古河」も田町電車区の185系で運用されるようになった。この年の春の大型連休に、八王子・新宿と成田空港を結ぶ臨時特急「ウイング」が田町電車区の185系電車B編成によって運行されたほか、1992年秋からは新宿と日光を結ぶ特急「日光」の運行が開始され、157系電車と同様のヘッドマークを装着した田町電車区の185系電車B編成が使用された。1993年1月からは「シュプール白馬号」のうち3号・4号に田町電車区の185系B編成が運用された。

thumb|新特急「あかぎ」
田町所属車 1993年の夏からは、高崎地区から日本海側へ向かう海水浴利用者のために運行された臨時快速列車「青海川」の1号・2号に、新前橋電車区の185系電車が運用されるようになり、185系電車で初めて日本海沿岸を運行する列車となった。1993年12月1日のダイヤ改正からは、新宿発着の「新特急ホームタウン高崎」「新特急あかぎ」が設定され、田町電車区の185系電車A編成が使用されるようになった。一方で、東海道線の田町電車区の185系電車C編成が使用されていた普通列車運用は他の形式への変更や廃止が行われたため、C編成単独の分割併合のない列車への運用は消滅した。1993年から1994年にかけて、田町電車区のクハ185とサロ185は便所が洋式に変更された。この年の「シュプール号」では、「シュプール上越号」のうち2号・3号が田町電車区の185系電車B編成からグリーン車を外した6両編成で運行されたが、この年から新設された「シュプール草津・万座」は新前橋電車区の185系電車が運用されることになった。この2列車は大船と新前橋の間を連結して運行する設定となったが、田町電車区の185系電車と新前橋電車区の185系電車が連結する運用はこれが初めてとなった。

153系電車・165系電車との連結に対応して設置されていたKE64形ジャンパ連結器は、0番台は全て撤去し、200番台は栓受けのみ残している。転落防止用外幌の設置は、田町電車区の車両は2002年に、新前橋電車区の車両は2004年に行われている。1996年から1999年にかけて、全編成の先頭車前面の列車番号表示器がLED式に変更された。

 

1999年以降リニューアルの
田町所属車

 

サロ185座席
リニューアル後

 

クハ185座席
リニューアル後

 

クハ185車内
リニューアル後

1998年に田町電車区のサロ185形はバケットタイプの座席への交換が行われた。1999年から2002年にかけて、田町電車区の185系電車もリニューアル工事が行われ、普通車の座席がリクライニングシートに交換されたほか、化粧板の交換などが行われ、普通車の仕切り扉はマットスイッチ式からセンサー式に変更された。外部塗装デザインは湘南色をあしらったブロックパターンへ変更された。

2004年10月15日限りで、高崎線で上り1本だけ残っていた普通列車運用から離脱した。その後、JR東日本の車両の検査体制の見直しに伴い、高崎車両センターに配置されていた185系電車は、全車両が2006年3月18日付で大宮総合車両センターへ転属となった。この転属後、高崎と横川の間に設定されていた間合い運用の普通列車は185系電車の運用ではなくなり、以後185系電車の普通列車は東京7:24発の伊東行き（列車番号521M）1本だけとなった。

2013年3月16日のダイヤ改正で、田町車両センターに配置されている車両がすべて大宮総合車両センターに転属した。これと同時に、改正前から大宮総合車両センターに所属している編成は、グリーン車の連結位置が田町車両センターに配置されていた車両に合わせて変更されたほか、方向転換を実施して車両の向きを揃えた。編成番号は転属後も変更されていない。このダイヤ改正以後、OM編成とB編成は共通運用されるようになった。また、朝方に東海道線で残っていた185系電車の伊東行き普通列車の運用が熱海までE231系電車に置き換えられ、普通列車運用は熱海 - 伊東間に縮小された。同センター東大宮センターとの間の車両の回送ルートに武蔵野線が使用されるようになったが、上野東京ライン開業後は同区間を経由して東大宮センターとの間を回送するようになった。

このダイヤ改正の前後から編成の組み替えが頻繁に行われている。OM編成は前述の方向転換の他に、湘南色となっていたOM03編成がB編成と同様の塗装デザインに変更されると同時に、グリーン車を抜き取り6両編成となった。B編成では、B1編成をのぞいて全編成グリーン車が抜き取られ、B2編成はB7編成からモハ185・モハ184-231のユニットを加えて8両編成となり、B7編成は4両編成となった。C編成は、C7編成がサハ185-7を抜き取って4両編成となった。サハ185-7は長野総合車両センターへ配給回送された後、2013年4月1日付で廃車となり、本系列で初の廃車車両となった。B編成から外されたグリーン車は2013年7月24日付・10月9日付の2回に分けて廃車となった。これらの動きは各種団体列車や波動輸送に使用されている同社の183系電車を置き換えるものと一部雑誌等で報じられており、実際に快速「ムーンライトながら」はもともとの183系電車に代わり、2013年 - 2014年冬期から185系電車で運用されるようになった。2014年4月にA8編成・C1編成に続いてB7編成がストライプ塗装に復元された。

2012年6月末時点では置き換え予定は未定とアナウンスされていたが、2014年3月15日のダイヤ改正で高崎線系統の特急が新宿発着の1往復を除いて651系電車に置き換えられ、7両編成の特急運用が消滅したほか、最後まで残っていた伊東線の普通列車運用も消滅した。これを受けて編成単位で廃車が開始され、2014年5月13日付でB1編成が廃車となり、グリーン車を組み込んだB編成は消滅した。一方、2014年8月1日からは同年度末の開業を控えた上野東京ラインの試運転列車に使用され、8月2日・8月3日の試運転ではOM06編成の編成の一部を組み込んで10両編成としたOM07編成が使用された。このOM07編成は編成中4両が2015年5月26日付で廃車となり、残る6両も2015年6月5日付で廃車になった。このほか、157系電車塗装だったOM08編成は2015年3月にストライプ塗装に変更された。当初から大宮配置のOM編成でこの塗装は初めてとなる。