Γαλακτοβάκιλλοι

Ανήκουν στην ευρύτερη ομάδα των βακτηρίων που παράγουν γαλακτικό οξύ («βακτήρια γαλακτικού οξέος» – LAB). Το γαλακτικό οξύ παράγεται μέσω μιας αναερόβιας διαδικασίας μεταβολισμού της γλυκόζης τους που λέγεται γαλακτική ζύμωση. Στην ομάδα αυτή ανήκουν επίσης τα γένη: Lactococcus (Γαλακτόκοκκος), Pediococcus (Πεδιόκοκκος), Leuconostoc, Streptococcus (Στρεπτόκοκκος), Enterococcus (Εντερόκοκκος), Vagococcus, Melissococcus (Μελισσόκοκκος), Oenococcus (Οινόκοκκος), Tetragenococcus, Bifidobacterium (Δισχιδοβακτήριο), Propionibacterium (Προπιονοβακτήριο).

Γαλακτοβάκιλλοι
Γαλακτοβάκιλλοι
Συστηματική ταξινόμηση
Επικράτεια: Βακτήρια (Bacteria) Συνομοταξία: Βακιλλωτά (Bacillota) ή Firmicutes Ομοταξία: Βάκιλλοι (Bacilli) Τάξη: Γαλακτοβακιλλώδη (Lactobacillales)

Σύμφωνα με τον μεταβολισμό τους διαιρούνται σε τρεις ομάδες:

• Ομοιοζυμωτικοί: Βάκιλλοι που μετατρέπουν περισσότερο από το 85% της γλυκόζης τους σε γαλακτικό οξύ με αρχική ένωση την γλυκόζη.
• Ετεροζυμωτικοί: Βάκιλλοι που μετατρέπουν λιγότερο από το 50% της γλυκόζης σε γαλακτικό οξύ και σε σημαντικά ποσά αιθανόλης, οξικού οξέος και CO₂.
• Ετεροζυμωτικά είδη (λιγότερα γνωστά): Βάκιλλοι που παράγουν DL - γαλακτικό οξύ, οξικό οξύ και CO₂.

Διάφορα μέλη των γαλακτοβακίλλων αφθονούν στη φυσιολογική χλωρίδα του ανθρώπου (γαστρεντερικό, ουροποιητικό, γεννητικό σύστημα) και συμβάλλουν σημαντικά στην ισορροπία της. Χρησιμοποιούνται ευρέως στην βιομηχανία τροφίμων και το ενδιαφέρον τις τελευταίες δύο δεκαετίες έχει εστιαστεί στις ευεργετικές τους ιδιότητες ως προβιοτικά. Η ταυτοποίηση των γαλακτοβακίλλων γίνεται στις περισσότερες περιπτώσεις με μοριακές μεθόδους επειδή είναι δύσκολη με τις κλασικές μεθόδους. Η ευαισθησία τους στα αντιβιοτικά είναι ειδική για το είδος και ποικίλει σημαντικά. Κάποια είδη εμφανίζουν αντοχή στην βανκομυκίνη, ενώ τα περισσότερα είναι ευαίσθητα στην πενικιλλίνη.

Οι ευεργετικές ιδιότητες των γαλακτοβάκιλλων για τον άνθρωπο

• Αποτελούν μέρος της φυσιολογικής χλωρίδας του ουρογεννητικού συστήματος της γυναίκας. Ο ρόλος τους είναι η αποτροπή της εγκατάστασης παθογόνων βακτηρίων, εξαιτίας της παραγωγής γαλακτικού οξέος. Επίσης έχουν τη δυνατότητα να ανταγωνίζονται άλλους μικροοργανισμούς ως προς την προσκόλληση στο κολπικό επιθήλιο.
• Αποτελούν μέρος της φυσιολογικής χλωρίδας του γαστρεντερικού συστήματος. Παρεμποδίζουν την εισβολή παθογόνων μικροβίων μέσω του πεπτικού.
• Χρησιμοποιούνται ευρέως στη βιομηχανία τροφίμων εξαιτίας των ζυμωτικών τους ικανοτήτων (π.χ. σαλάμι, γαλακτοκομικά, είδη ψωμιού, μπύρα, κρασί, ξινολάχανο, πίκλες κλπ)
• Παρέχουν πιθανώς θεραπευτικές ικανότητες ως προβιοτικά. Ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα, παράγουν πολύτιμα αντιοξειδωτικά, βελτιώνουν την απορρόφηση βιταμινών, αμινοξέων και μετάλλων, προλαμβάνουν τροφικές δηλητηριάσεις.

Οι Γαλακτοβάκιλλοι ανήκουν στη συνομοταξία Firmicutes στην τάξη Lactobacillales η οποία συμπεριλαμβάνει και την οικογένεια Lactobacillaceae. Στο γένος Lactobacillus έχουν περιγραφεί πάνω από 125 είδη.

Οι γαλακτοβάκιλλοι, είναι θετικά κατά Γκραμ βακτήρια, μη σπορογόνα, με τα περισσότερα είδη τους να είναι ακίνητα, ενώ πιο σπάνια είδη έχουν τη δυνατότητα να κινούνται με την βοήθεια βλεφαρίδων. Συχνά εμφανίζονται σαν επιμήκη και λεπτά βακτηρίδια ίσια ή με μικρή κάμψη και ποικίλα στο μήκος και το πλάτος τους. Μπορεί όμως να εμφανιστούν και με κοκκοειδή μορφή ή ως κορύνες. Διατάσσονται σε μακριές αλυσίδες βακτηριδίων ή νήματα. Η χρώση τους κατά Gram εξαρτάται από το θρεπτικό υλικό ανάπτυξης.

1. Η ανάπτυξή τους σε υγρά θρεπτικά υλικά δίνει αξιόπιστες πληροφορίες για την μορφολογία τους.
2. Η ανάπτυξη σε στερεά υλικά μπορεί να οδηγήσει σε ψευδή αποτελέσματα λόγω του ότι η μορφή τους μπορεί να είναι κοκκοειδής.

Οι φυσικοχημικές ιδιότητες των γαλακτοβάκιλλων είναι:

• Προαιρετικά αναερόβια βακτήρια.
• Επιτελούν την γαλακτική ζύμωση (διάσπαση της γλυκόζης και άλλων σακχάρων σε γαλακτικό οξύ).
• Εμφανίζουν πολύπλοκες διατροφικές απαιτήσεις.
• Κάποια είδη έχουν μεγάλη αντοχή σε H₂O₂ (οξυζενέ).
• Δεν παράγουν καταλάση, οξειδάση, νιτρικά, ινδόλη και H₂S.
• Δεν ρευστοποιούν την ζελατίνη.
• Το κυτταρικό τους τοίχωμα αποτελείται από ένα παχύ στρώμα πεπτιδογλυκάνης και τειχοϊκά οξέα κολλημένα στην μεμβράνη.
• Η άριστη θερμοκρασία ανάπτυξης τους είναι 30 - 40°C και ορισμένα είδη είναι θερμόφιλα.
• Το ιδανικό pH για την ανάπτυξή τους είναι 5,5 - 5,8.
• Έχουν την ικανότητα να παράγουν πρωτεΐνες με μικροβιοκτόνες ιδιότητες που λέγονται βακτηριοσίνες.

Οι γαλακτοβάκιλλοι καλλιεργούνται σε γάλα, μέσω των ακόλουθων διεργασιών4,7.

• Proteolicis: Διάσπαση πρωτεϊνών σε πιο εύκολα απορροφήσιμα συστατικά.
• Λιπόλυση: Διάσπαση των σύνθετων λιπών σε πιο εύκολα απορροφήσιμα συστατικά.
• Μεταβολισμού λακτόζης: Διάσπαση της λακτόζης προς γαλακτικό οξύ.

Αρνητικοί παράγοντες ανάπτυξης γαλακτοβάκιλλων

Μερικές σπερματοκτόνες και αντισυλληπτικές κρέμες μπορεί να σκοτώσουν την φυσιολογική χλωρίδα του κόλπου (π.χ. γαλακτοβάκιλλοι), με αποτέλεσμα την πιθανή εμφάνιση βακτηριακής κολπικής μόλυνσης.

Συνθήκες ανάπτυξης γαλακτοβακίλλων

Οι γαλακτοβάκιλλοι επιβιώνουν σε συνθήκες πεπτικού συστήματος οι οποίες περιλαμβάνουν:

• Χαμηλό pH του στομάχου (επιβιώνουν σε pH στομάχου ίσο με 3).
• Παρουσία πρωτεολυτικών ενζύμων.
• Παρουσία χολικών αλάτων.
• Επιβίωση παρουσίας παγκρεατίνης στο περιβάλλον του λεπτού εντέρου (pH = 8).

Η σημαντικότερη εξέταση σε γυναικολογικές παθήσεις, η οποία σχετίζεται με την ανίχνευση των γαλακτοβακίλλων και άλλων παθογόνων μικροβίων, είναι αυτή του κολπικού υγρού η οποία περιλαμβάνει:

1. Άμεσο παρασκεύασμα.
2. Καλλιέργεια κολπικού υγρού.
3. Χρώση κατά Gram (ανιχνεύονται θετικά κατά Gram βακτήρια και φυσιολογική χλωρίδα κόλπου).
4. Έλεγχος μυκοπλασμάτων.

Σήμερα θεωρείται ότι έχουν χαμηλή λοιμογόνο δράση, μπορούν όμως να προκαλέσουν λοιμώξεις σε ειδικές ομάδες ασθενών (π.χ.. HIV, καρκίνος, μεταμόσχευση, σακχαρώδης διαβήτης). Οι συχνότερες λοιμώξεις από γαλακτοβάκιλλους είναι η βακτηριαιμία και η ενδοκαρδίτιδα με ή χωρίς βακτηριαιμία, ενώ σπανιότερα μπορεί να προκαλέσουν αποστήματα ήπατος και σπλήνα, περιτονίτιδα, ουρολοιμώξεις, χοριοαμνιονίτιδα, νεογνική μηνιγγίτιδα, ενδομητρίτιδα, πνευμονία και σηπτική αρθρίτιδα . Χαρακτηριστικό παράδειγμα γαλακτοβακίλλων που αποτελούν μέρος της φυσιολογικής χλωρίδας του ανθρώπου είναι οι γαλακτοβάκιλλοι doderiayn (απ’ το γυναικολόγο που το ανακάλυψε το 1982). Ο όρος αυτός χρησιμοποιείται για να περιγράψει βακτήρια που παράγουν γαλακτικό οξύ και εμποδίζουν με αυτόν τον τρόπο την αύξηση των παθογόνων βακτηρίων. Αν και η παθογονικότητά τους θεωρείται χαμηλή, σπάνια απομονώνονται από κλινικά δείγματα. Οι συχνότερες λοιμώξεις από γαλακτοβακίλλους είναι η βακτηριαιμία και η ενδοκαρδίτιδα, με ή χωρίς βακτηριαιμία, ενώ σπανιότερα έχουν αναφερθεί αποστήματα και άλλες εντοπισμένες λοιμώξεις.

Καλλιέργεια

Αναπτύσσονται σε αιματούχο άγαρ και μετά από 24 ώρες δημιουργούν μικρές αποικίες 2-5 mm κυρτές και λείες με σαφή όρια. Μπορεί επίσης να παρατηρηθεί αιμόλυση και γκριζάρισμα του θρεπτικού υλικού. Τα περισσότερα είδη της εντερικής χλωρίδας αναπτύσσονται καλύτερα σε αναερόβιες συνθήκες, ενώ τα είδη που χρησιμοποιούνται στην βιομηχανία αναπτύσσονται σε μικροαερόφιλες ή αερόβιες συνθήκες. Το άριστο pH ανάπτυξης στη καλλιέργεια είναι 5,4. Για την μελέτη γαλακτοβακίλλων της φυσιολογικής χλωρίδας έχουν χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν διάφορα θρεπικά υλικά όπως Rodosa άγαρ και MRS άγαρ που περιέχει μαλτόζη.

Χημικές δοκιμασίες

• Παραγωγή H₂O₂.
• Καταλάση, οξειδάση (-) αρνητικές.
• Αντοχή στη βανκομυκίνη (αντιβιοτικό) για κάποια είδη.
• Παραγωγή αερίου από τη διάσπαση της γλυκόζης σε MRS ζωμό.
• Υδρόλυση αργινίνης.
• Δοκιμασία ζύμωσης με χρήση ταινιών API50CH.
• Αυτοματοποιημένα συστήματα.

Μοριακές μέθοδοι

Στηρίζονται στην ανίχνευση γαλακτοβακίλλων και την ταυτοποίησή τους στους διάφορους τύπους στελεχών. Έχουν περιγραφεί μέθοδοι που βασίζονται στην PLR και realtime PCR.

Ευαισθησία στα αντιβιοτικά

Τα περισσότερα είδη είναι συνήθως ευαίσθητα στην πενικιλλίνη και στις κεφαλοσπορίνες. Παρ’ όλα αυτά οι γαλακτοβάκιλλοι είναι ευαίσθητοι σε μακρολίδες, κλινδαμυκίνη, τετρακυκλίνες και χλωραμφενικόλη.

Αντίδραση κατάλασης

Στόχος:

1. Διαπίστωση παρουσίας του ενζύμου καταλάσης σε ζωικούς ή φυτικούς οργανισμούς.
2. Ανίχνευση αερίου Ο₂ που παράγεται από την διάσπαση Η₂Ο₂ (οξυζενέ - φυσαλίδες).
3. Παρατήρηση της επίδρασης της θερμοκρασίας και του pΗ στην δράση ενζύμου.

Οι γαλακτοβάκιλλοι δίνουν αρνητική την αντίδραση της καταλάσης στο εργαστήριο μετά την μεταφορά σε αντικειμενοφόρο πλάκα με κρίκο αποικίας μικροβίων και μία σταγόνα αντιδραστηρίου.

• Αντοχή στην βανκομυκίνη: Με αυτή την δοκιμασία ελέγχεται η θνησιμότητα των γαλακτοβακίλλων γύρω από δισκία αντιβιοτικών (βανκομυκίνη).
• ΜRS ζωμός και παραγωγή αερίου: Μ’ αυτή την δοκιμασία ελέγχεται η παραγωγή αερίου από τη διάσπαση γλυκόζης σε ειδικά υλικά (π.χ. MRS ζωμός).
• Δοκιμασία ζύμωσης: Με αυτή την τεχνική ελέγχουμε την παραγωγή γαλακτικού οξέως μετά από την διάσπαση σακχάρου.
• Οι γαλακτοβάκιλλοι δίνουν αρνητική την δοκιμασία οξείδωσης μετά την εμπότιση απορροφητικού χαρτιού με διάλυμα 1% ειδικού αντιδραστηρίου και την μεταφορά σε αυτά μιας αποικίας μικροβίων.

Ανίχνευση γαλακτοβακίλλων

Χρησιμοποιείται το BDLBS άγαρ στο οποίο ενοφθαλμίζεται δείγμα υλικού το οποίο χρησιμοποιείται για μελέτες σε ασθενείς που πάσχουν από χρόνια διάρροια και φέρουν χλωρίδα γαλακτοβάκιλλων σε δείγμα κοπράνων. Στο άγαρ αυτό οι γαλακτοβάκιλλοι εμφανίζονται σαν λευκές αποικίες. Στα τρυβλία, αυτές οι αποικίες μπορούν να μετρηθούν ποσοτικά. Μειωμένη παρουσία γαλακτοβακίλλων στην φυσιολογική χλωρίδα μπορεί να υποδηλώνει κάποια μικροβιακή λοίμωξη. Σε δείγματα κοπράνων ή κολπικά δείγματα υγιών ατόμων οι γαλακτοβάκιλλοι υπάρχουν σε αυξημένο αριθμό.

• Παραγωγή αντιμικροβιακών ουσιών (βακτηριοσίνες, οργανικά οξέα).
• Ανταγωνισμός με παθογόνα μικρόβια (θέσεις πρόσδεσης, θρεπτικά συστατικά).
• Συμβολή στην ομαλή λειτουργία του εντέρου (αποτελούν μέρος της μικροβιακής χλωρίδας του εντέρου).
• Ρύθμιση ανοσοποιητικού συστήματος.

Οι γαλακτοβάκιλλοι είναι οι κύριες προβιοτικές ομάδες στο ανώτερο και κατώτερο τμήμα των εντέρων και πολλές φορές χρησιμοποιούνται για θεραπευτικούς σκοπούς.

Lactobacillus acidophilus

• Προλαμβάνει και θεραπεύει την διάρροια.
• Αποκαθιστά την φυσιολογική χλωρίδα του εντέρου που έχει καταστραφεί από αντιβιοτικά.
• Προλαμβάνει τις μυκητιάσεις του ουροποιητικού συστήματος, κυρίως στις γυναίκες.
• Βελτιώνει την πέψη.
• Ενισχύει την άμυνα του ανοσοποιητικού. Υπάρχουν μελέτες που δείχνουν ότι μπορεί να βοηθά στον καρκίνο παχέος εντέρου.

Lactobacillus bulgaricus

• Μελέτες δείχνουν ότι παράγει μια ιντερφερόνη που βοηθά στην αντιμετώπιση συμπτωμάτων, όπως η έντονη διάρροια.
• Χρησιμοποιείται στην ζύμωση του φυσικού γιαουρτιού.
• Παράγουν γαλακτικό οξύ χρησιμοποιώντας την γλυκόζη.

Lactobacillus paracasei

• Χρησιμοποιείται συχνά για καλλιέργεια γάλακτος.
• Αποτελεί μέρος της φυσιολογικής χλωρίδας στο στόμα και το πεπτικό σύστημα.
• Εμποδίζει την ανάπτυξη παθογόνων και σηπτικών βακτηρίων στο έντερο.
• Ενισχύει το ανοσοποιητικό σύστημα (κυτταρική ανοσία).
• Αποσυνθέτει τους υδατάνθρακες.
• Ενισχύει το ανοσοποιητικό σύστημα με ενεργοποίηση των ΝΚ κυττάρων.